【摘要】本研究以内皮细胞培养液（Ed?M）培养小鼠骨髓内皮细胞，探讨粒?巨噬系集落刺激因子（rGM?CSF）对骨髓内皮细胞增殖的影响。用Ed?M培养小鼠骨髓内皮细胞，通过Wrht?Gs染色计数内皮细胞集落、应用免疫荧光法观察内皮细胞表型；加入不同浓度的GM?CSF，通过集落形成率、MTT法和流式细胞术检测内皮细胞生长周期，观察GM?CSF对内皮细胞体外扩增的影响。结果表明：Ed?M诱导的骨髓细胞可以生成内皮细胞集落，vWF检测呈阳性；集落形成率检测及MTT法测定均证实GM?CSF对内皮细胞的增殖具有明显的促进作用；生长周期检测结果显示，GM?CSF处理组的细胞进入S期的比率为93%，而对照组为2%，说明GM?CSF可以通过促使内皮细胞进入S期而加快细胞的分裂，促进细胞增殖；比较第代和第4次传代后细胞的生长曲线，两者无明显差别，说明多次传代后的细胞仍保持传代早期的增殖潜能。结论：GM?CSF对内皮细胞的增殖具有促进作用，经多次扩增传代后内皮细胞的增殖潜能无明显改变。
【关键词】骨髓内皮细胞 GM?CSF 细胞增殖
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Kyrdsbrrdthlllls;GM?CSF;prlfrt
JExpHtl2007;5(3):622-625
目前，已有许多报道证明内皮细胞（dthlllls,EC）、内皮祖细胞（dthllprtrlls,EPC）可以用来治疗缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血［,2］也可以用于组织工程的血管构建［3］，并取得了一定的成果。Kt等［4］报道，EPC对缺血心脏病进行治疗具有良好的效果，一方面减少了缺血组织的面积，同时改善了心脏的功能。Kl等［5］则报道了利用EPC对肢体缺血的小鼠模型进行治疗，实验结果表明了EPC能显著增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。内皮细胞的来源有多种，可以从外周血、脐血及骨髓中获得［6］，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液（Ed?M）体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒?巨噬系集落刺激因子（rGM?CSF）对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞治疗疾病有一定的指导意义。
动物
昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。
主要试剂和仪器
IMDM为Gb公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；重组小鼠粒?巨噬细胞集落刺激因子（rGM?CSF）为R&D公司产品；vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IG为S公司产品；MTT、二甲基亚砜（DMSO）为S公司产品；酶标仪为Ars公司产品；CO2培养箱购自美国Fr。
小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养
用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取×06个小鼠骨髓单个核细胞种入l含有5%新生牛血清的Ed?M培养体系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔×04个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养5天后计数内皮细胞集落数，以≥50个细胞的聚合计为个集落。
内皮细胞的形态观察及vWF的检测
培养的骨髓内皮细胞集落经Wrht?Gs染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免疫荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小时，加入vWF抗体，4℃过夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3?IG，37℃孵育60分钟,PBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株［7］为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。
不同浓度的GM?CSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响
取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5000个细胞，在基本培养体系（含%浓度Ed?M）的基础上分别加入5、0、25/l的rGM?CSF，对照组不加入GM?CSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养5天，于倒置显微镜下记数集落数，≥50个细胞的聚合计为个内皮细胞集落。
GM?CSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定
将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5000个/孔培养于96孔板，每孔02l，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、00/l的rGM?CSF，对照组内不加。在37℃、5%CO2、饱和湿度下分别培养5天和0天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM80μl和20μlMTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO50μl，振荡0分钟，使结晶充分溶解。选择492波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD492）。
生长曲线
纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5000个细胞，加02l含5%新生牛血清的基本培养液，并加入25/l的rGM?CSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、、3、5天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式DT=t×2/(N-N0)算出第代内皮细胞生长的倍增时间。
细胞周期的流式细胞术检测
无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2×06个细胞种于6孔培养板中（2l培养体系中含5%新生牛血清的Ed?M），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含5%新生牛血清的IMDM，实验组加5%新生牛血清的IMDM和00/l的rGM?CSF，每组各0孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞，200×,离心5分钟，用PBS洗涤细胞2次之后，用300μlPBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）约700μl（终浓度为70%），将细胞放于-20℃过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。
细胞传代培养
取小鼠骨髓单个核细胞，按2×06个细胞种于6孔培养板中（2l体系中含5%新生牛血清的Ed?M），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入5%新生牛血清的IMDM培养液和00/l的rGM?CSF，促使细胞融合，再按∶4传代于6孔板中，同样加入5%新生牛血清的IMDM和00/l的rGM?CSF，等细胞生长至融合，按∶4传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式DT=t×2/(N-N0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第代的倍增时间进行比较。
统计学处理
实验数据为3次结果，以±SD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SPSS软件分析，P<005表示有统计学意义。
结果
细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rGM?CSF5、0、25/l。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（图3），说明rGM?CSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。
rGM?CSF对内皮细胞增殖的影响
小鼠骨髓内皮细胞培养5、0天，分别进行MTT的检测，结果表明rGM?CSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（P<00）（图4）。
GM?CSF对EC细胞周期的影响
运用流式细胞仪检测细胞周期，观察GM?CSF对EC细胞周期的影响。结果显示GM?CSF使细胞进入S期的比例为93%，与对照组2%相比有明显差别。此结果说明GM?CSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖（图5）。Fur5EfftfGM?CSFllylfdthllllsA:ruptrtdbyGM?CSFB:trlrup
体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响
图6为小鼠骨髓第代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式［DT=t×2/(N-N0)］计算出第、4代细胞生长的倍增时间分别为3025±055小时、367±026小时。第代与第4代的细胞倍增时间相比，无明显差异，表明经体外扩增传代4次，仍能保持传代早期的增殖潜能。
Fur6Grthurvfthfrstdfurthpssrtsfurbdthlllls讨论
国内外对于骨髓内皮细胞的纯化报道较少，但已经进行了一些关于细胞因子对内皮细胞增殖影响的研究，如Yur等［8］报道VEGF可以促进内皮细胞的增殖，R等［9］则报道bFGF可促进角膜内皮细胞的生长。我们此前曾报道了VEGF、bFGF、SCF、IL?6、GM?CSF等对内皮细胞株的增殖有促进作用［0］。GM?CSF对未经转化的骨髓内皮细胞增殖的作用尚未见报道。本研究中，我们用本室配制的培养基在较短的时间内纯化了小鼠的骨髓内皮细胞，vWF为阳性，并在此基础上观察了GM?CSF对骨髓内皮细胞增殖的影响。应用基本培养基培养内皮细胞集落时，形成的集落数较少，加入rGM?CSF后，集落生成明显增多。MTT的结果亦支持GM?CSF对小鼠骨髓内皮细胞生长的刺激作用。细胞生长曲线的结果表明，在含GM?CSF培养的条件下，内皮细胞生长的倍增时间为3025±055小时，经4次传代后细胞倍增时间无明显延长，表明体外培养扩增4代后，细胞仍能保持早期的增殖能力，GM?CSF对骨髓内皮细胞的体外增殖有明显刺激作用。文献报道内皮细胞表面有GM?CSFR的存在，而内皮细胞本身也可以分泌GM?CSF［］。结合细胞周期测定的结果，可以认为，GM?CSF促内皮细胞增殖的机制可能是GM?CSF与GM?CSFR结合，通过细胞内信号传递使更多的细胞进入S期来实现的。
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